Abstract

Wstęp: Rutynowa analiza toksykologiczna materiału biologicznego obejmuje najczęściej badania w kierunku identyfikacji związków o różnym charakterze, właściwościach i budowie organicznej lub nieorganicznej, jednak o masie nieprzekraczającej 500–600 Da. Większość związków organicznych to cząstki o stosunkowo niewielkiej masie. Zupełnie odmienną grupą analityczną są związki o budowie peptydowej i masie przekraczającej 900 Da, będące składnikami wielu toksyn, szczególnie grzybów kapeluszowych czy jadów zwierzęcych. Celem pracy było przedstawienie analitycznej specyfiki związków o strukturze peptydowej na przykładzie alfa-amanityny, oznaczanych w powszechnie stosowanych układach LC-MS/MS, na podstawie badań własnych. Materiały i metody: Materiał badawczy stanowił mocz pobierany od pacjentów w ramach rutynowej diagnostyki zatruć grzybami, analizowany pod kątem obecności alfa-amanityny. Mocz poddany został ultrafiltracji na filtrach wirówkowych o odcięciu masowym 3 kDa; przesącz poddano bezpośredniej analizie chromatograficznej z detekcją mas. Wyniki: Peptydy jako grupa związków organicznych wykazujących właściwości amfoteryczne przy stosunkowo dużej masie cząsteczkowej mogą być ekstrahowane w układzie fazy stałej, jednak na dedykowanych kolumnach. W pracy wykazano, iż zastosowanie ultrafiltracji na etapie przygotowania próbek do analizy pozwala na skuteczną izolację alfa-amanityny, przy zachowaniu wymaganej czułości oznaczenia i ograniczeniu wpływu matrycy na sprawność układu analitycznego. Specyfiką peptydów jest także ich mało charakterystyczna fragmentacja, skutkująca jedynie intensywnym sygnałem o masie M-18 Wykorzystanie tego przejścia masowego w trybie pomiaru MS/MS nie pozwala jednak na uzyskanie całkowicie selektywnego chromatogramu. Zastosowanie wyższych energii kolizyjnych prowadzi do uzyskania bardziej charakterystycznego widma masowego, jednak skutkuje to jednoczesnym spadkiem czułości oznaczenia. Wnioski: Ultrafiltracja jako etap przygotowania próbek w analizie alfa-amanityny jest efektywną metodą izolacji peptydów z matrycy. Monitoring przejścia masowego w trybie MS/MS z utratą cząsteczki wody pozwala na uzyskanie wysokiej czułości oznaczenia.

Authors and Affiliations